Cell：刘如谦团队进化出更高效、更紧凑的精准基因编辑工具“先导编辑器”，为治疗应用扫除障碍

发布于:基因生物研究 2023-09-03 3133

2019年10月21日，刘如谦（David Liu）团队在 Nature 发表论文，开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editing，PE），无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除。该工具“理论上可以修复75000种已知致病性人类遗传变异的89%”。

此后几年时间里，全世界各地数百个实验室纷纷证实了先导编辑的强大性，刘如谦也围绕该技术创建了新公司 Prime Medicine，该公司于2022年10月在纳斯达克上市。

但先导编辑（PE）也面临着一个重要挑战，相比其他基因编辑工具，先导编辑的效率还是太低了。此前在活体动物中进行的研究显示，先导编辑的体内编辑效率大约只有5%，这个效率对大多数疾病难以产生实际治疗效果。

2023年8月31日，刘如谦团队在 Cell 期刊发表了题为：Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors 的研究论文，对先导编辑（PE）系统进行了优化和改进，使其进化成更高效的基因编辑工具。

该研究通过噬菌体辅助进化（PACE）技术和蛋白质工程开发了先导编辑（PE）系统的改进版本。新的PE系统拥有更高的基因编辑效率，能够编辑此前难以编辑的细胞和动物器官中的DNA——包括免疫细胞和活体小鼠的大脑。此外，该系统所具有的更小、更紧凑的蛋白结构也使其更容易递送。

先导编辑（PE）系统系统由多种分子机器组合而成：一种部分失活的Cas9切口酶（Cas9 nickase，nCas9），它可以产生DNA单链切口；一种工程化的PE向导RNA （pegRNA），它既指定了编辑的位置，也包含了替换该位点的新遗传指令；以及一种逆转录酶的工程版本，它使用RNA作为模板对DNA进行特定的改变。

先导编辑系统由两部分组成：一个含有DNA切口酶（Cas9 nickase，nCas9）和工程逆转录酶（RT）的融合蛋白；另一个是PE向导RNA——pegRNA。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔体（spacer），一个单向导RNA（sgRNA）支架和一个编码所需编辑的3'端扩展。

该3'端扩展包含一个引物结合位点（PBS），它是互补的一部分DNA原间隔和一个RT模板，编码所需的编辑和下游基因组序列。PE系统与靶位点结合后，将含有PAM序列的DNA链切出，切出的DNA链碱基对与pegRNA中的PBS结合，从而将反转录的编辑序列直接引到靶DNA位点。新合成的编辑DNA的3'端随后通过细胞DNA修复途径分解，最终在目标位置进行所需的编辑。

先导编辑系统工作示意图

PE系统有望纠正大多数导致疾病的基因突变，但其效率可能因编辑的位置和类型以及被编辑的细胞类型而有很大差异。在某些情况下，只有百分之几的细胞能够倍成功编辑。

为了提高PE系统的编辑效率，刘如谦团队一直致力于不断优化和改进PE系统的每个部分。此前，研究团队已经优化了pegRNA和细胞对PE编辑的反应方式。在这项最新研究中，他们专注于改进PE系统的核心——逆转录酶。

PACE进化获得逆转录酶变体

在自然界中，逆转录酶广泛存在于所有植物和动物细胞以及许多病毒中，它可以依照RNA模板合成与之互补的DNA链。然而，天然的逆转录酶通常导致较差的PE编辑效率，因此，PE系统通常采用人工改造的工程逆转录酶。

为了更有针对性地优化PE编辑器的逆转录酶结构域，刘如谦团队转向噬菌体辅助进化（PACE）技术，这是刘如谦团队在2011年开发的一种蛋白质定向进化方法。

简单来说，PACE技术模拟了物竞天择的自然进化筛选过程：首先需要培养多种快速进化的噬菌体，同时对其进行不断稀释，而只有那些表达具有特定理想特征的蛋白变体的噬菌体才能通过比稀释速度更快的复制速度存活下来。

开发和验证PE编辑器的PACE选择

在这项新工作中，研究团队开发了一种PACE系统，该系统可以对有缺陷的噬菌体基因进行PE编辑，从而对噬菌体进行达尔文选择。在数百小时的时间里，携带原始PE编辑器的噬菌体经历了数千代的进化，迅速产生具有全新结构的逆转录酶。

刘如谦团队由此产生了一套新的PE编辑器——从PE6a到PE6g，每个系统都包含一个新的逆转录酶或Cas9变体。研究团队用不同类型的基因编辑任务测试了这些新的PE编辑器，他们发现，PE6a到PE6g具有不同的编辑偏好，它们仅在某一类基因编辑任务（例如插入短DNA片段）中提高了编辑效率，但其他情况下表现不佳。